2019年（nián）10月1日，5-羟甲基化胞（bāo）嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿病（bìng）研究领域取得重要进展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的（de）血（xuè）管（guǎn）并发（fā）症是导致2型糖尿病（bìng）致残致（zhì）死的重要（yào）病因，一（yī）直缺乏一种（zhǒng）无创便捷的临（lín）床途径实现血管（guǎn）并发症的发（fā）生（shēng）发展（zhǎn）监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人（rén）的整体生活（huó）质量，减少卫生经济负担。

该（gāi）研究入组了62例2型糖尿（niào）病病人，采用5hmC-Seal技术对（duì）血浆cfDNA中（zhōng）表观遗传标志物5hmC的分布情况进行检测，分析5hmC标志物与2型（xíng）糖尿（niào）病血管并发症（zhèng）发生发展的相（xiàng）关性。结果表（biǎo）明（míng）5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微（wēi）血管事件具有（yǒu）相关性，主要（yào）涉及一些与血管生物学和糖尿（niào）病（包括胰岛素耐（nài）受和（hé）炎症反（fǎn）应）相（xiàng）关（guān）的基因和信（xìn）号通路。该（gāi）研究建（jiàn）立的（de）16个基因-5hmC标志物组合检测可（kě）以准确区分（fèn）有（yǒu）并发症和无并发症的2型糖尿（niào）病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变量例如白蛋白尿。除此之外（wài），还建立了13个（gè）基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测，可（kě）以进一步区分（fèn）T2D合并单一并发症和（hé）多种并（bìng）发症（zhèng）[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于（yú）其他传（chuán）统临（lín）床变量。该研（yán）究得出结论，5hmC标志（zhì）物反映了T2D病人大血管/微（wēi）血管并发（fā）症发生过程中的表观遗传变化，因（yīn）而5hmC-Seal检（jiǎn）测技术在监测糖尿（niào）病血管并发症发生和进展方（fāng）面具有良好的临床应用前（qián）景。

本研究共纳（nà）入62例2型糖尿病（bìng）病人（rén），包括没有血（xuè）管（guǎn）并（bìng）发症（zhèng）的病人（rén）12例，有单一血管（guǎn）并发症的病人34例（24例发生大（dà）血管事件，10例（lì）发生微血管事件），以及有多种血管并发症的病人16例。试（shì）验收集62例病人血（xuè）浆（jiāng），提取cfDNA，利（lì）用5hmC-Seal技术捕获（huò）外周血cfDNA中的5hmC序列，进行（háng）二代测序，通（tōng）过生物信息学分析找（zhǎo）出（chū）并（bìng）发症组与无并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修（xiū）饰差异的（de）基（jī）因，单（dān）一（yī）并发症组和多种并发症组之（zhī）间有显著（zhe）5hmC修饰差异的（de）基因。随后利用回归模型对差异基因进一步筛选、优化，弹性网络进一步（bù）筛选，计算（suàn）加（jiā）权（quán）平（píng）均分，最后（hòu）得到一组具有高度灵敏（mǐn）度（dù）和特异（yì）性的5hmC生物标记物，并进一步在实（shí）验组（zǔ）中验证，分析其灵敏度和特异性。并将新建（jiàn）立（lì）的（de）5hmC标志（zhì）物基因组合的检测性能（néng）与（yǔ）传统（tǒng）临床变（biàn）量进行对比分析。最后对相关（guān）基（jī）因（yīn）进行了信号通路分析和功能（néng）探究。

5hmC修饰水平与血（xuè）管并发症具（jù）有相关性

利用逻辑回归模（mó）型（xíng）对62例（lì）有并发症和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异（yì）水平（píng）进（jìn）行分析（xī）发现，有并发症2型（xíng）糖（táng）尿（niào）病病人的622个差异修（xiū）饰候选基（jī）因（包括上调和下（xià）调（diào）基（jī）因）的（de）归一化平均数要明显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单（dān）一并发症和多发（fā）并（bìng）发症病人之间（jiān）没有显著差异。

之后将有（yǒu）单一并发症（zhèng）或多种并发症的50例病人用逻辑回（huí）归模型进行了对比，发现多种并发症的病人的153个差（chà）异修饰（shì）候选基（jī）因（包（bāo）括上调和下调基（jī）因）的归一化平均（jun1）数要低于无并发症病人（rén）（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物可区分（fèn）有无并发症（zhèng）患者

62例2型糖尿病病人被随机（jī）分（fèn）成（chéng）训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网络筛选后（hòu）发（fā）现，16基因-5hmC标（biāo）志物组合（hé）检测（cè）可以用（yòng）于区分有并发症和无（wú）并（bìng）发症的2型（xíng）糖尿病病人。

基于16基（jī）因组合模型 (Detection Model 1) 的加（jiā）权（quán）平均分分析，发现无并发症病（bìng）人的分数在训练集和测（cè）试集中都明（míng）显低于有并（bìng）发症的病人。只考虑加（jiā）权平均分的话，受试（shì）者工作特征（zhēng）曲线（xiàn）（ROC）分析（xī）表明将cutoff值设（shè）置成0.5时，在测试（shì）组中（zhōng）中的灵敏度为60%，特（tè）异（yì）性为100%。

5hmC标（biāo）志物可区（qū）分病人是单一并发（fā）症还是（shì）多种并发症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随机分成训练（liàn）组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络筛选后发现，13基因-5hmC标志物组合可以区分（fèn）2型糖尿病（bìng）病人是否（fǒu）发（fā）生单一（yī）并发症或多（duō）种并发症（zhèng）。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们（men）计算（suàn）了单一（yī）并发症（zhèng）和多种并发（fā）症的加权平均（jun1）分，发现在训练集和测试（shì）集中（zhōng）单（dān）一并发症和多种并发症病人的分数都（dōu）有明（míng）显差异。值（zhí）得一提的是，有肾病并发症和无肾病并发症病人（rén）的分数也有明显差异。利用加（jiā）权（quán）平均（jun1）分作为判断（duàn）标准的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测（cè）试组中当将cutoff值设成（chéng）0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统（tǒng）临床变（biàn）量/危险（xiǎn）因子的（de）对比

我们评（píng）估了不同临床变量/危险因子用于监测血（xuè）管并（bìng）发（fā）症的灵敏度和特（tè）异性（见表1）。

信（xìn）号通路分析和功（gōng）能探究

有并发症（zhèng）和无并（bìng）发症（zhèng）病人的135个差异候选基因的功能（néng）注释（shì）分析表明，这（zhè）些基因主要富集在一些（xiē）经典的信（xìn）号通路。错（cuò）误（wù）发现率相关（guān）P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所（suǒ）介（jiè）导的信号（hào）通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰岛素（sù）抵抗及炎症反应相关（guān），在血管生物学（xué）和糖尿病发（fā）生发展（zhǎn）过程中（zhōng）发挥（huī）重（chóng）要（yào）作用。

Reactome相互作用网络的中（zhōng）心表明，泛素（sù）编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的（de）重要连接（jiē）者。在这135个差异候选（xuǎn）基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与（yǔ）糖尿病病（bìng）程相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病血（xuè）管并发症之（zhī）间可能（néng）存在时间依赖性的相互作用。基于纵向时间队列的（de）大样本研（yán）究（jiū），将可进（jìn）一步明确5hmC变化（huà）和糖尿病持续时间之间的动态关联。关于单一并发症和多种并发症病（bìng）人的159个候选（xuǎn）标志基（jī）因的功能注（zhù）释研究发（fā）现，存在细胞-细胞（bāo）连接、胶（jiāo）原蛋白形（xíng）成（chéng）、新（xīn）陈代谢（xiè）、细胞应激应（yīng）答信号通路的富集，这些信号通路均与细胞基本功能密切相关。

血管并发症是三分之（zhī）二糖尿病病（bìng）人的死亡原因（yīn），若能及早（zǎo）有效控制血管并发症的发生，将极大地改善糖尿病病人的生存质量。该研究建立了一种利用cfDNA进行（háng）2型糖尿病血管并（bìng）发（fā）症监测（cè）的（de）无创便（biàn）捷（jié）方法，较（jiào）目前临床标志物能（néng）更（gèng）准确地（dì）监控血管（guǎn）并发症的发生（shēng），从（cóng）而提示临床及早采取应对措施（shī），有效控制病（bìng）情进展（zhǎn）。